Иммунологии вскоре предстоит занять весьма важное место в структуре фундаментального медико-биологического образования. Мы не знаем ни одного даже самого узкого медицинского специалиста, способного обойтись без иммунологии: она нужна либо для понимания патогенеза болезней, либо для проведения иммуноанали-зов, а чаще и для того, и для другого. Но хотя в практике клинических и биологических исследований иммунологические методы лидируют, в программе шестилетнего высшего врачебного образования почти не предусмотрено их профессиональное изучение. Не зная технологий современных иммуноанализов, врач не в состоянии самостоятельно понять, что факт наличия той или иной инфекции в крови пациента (положим, ВИЧ) можно надежно установить с вероятностью 100% (пусть для этого надо будет выполнить не одно, а несколько разных исследований), а вот факт отсутствия инфекции нельзя надежно установить никакими методами.

Цель данного учебного пособия — познакомить студентов и врачей на профессиональном уровне с современными методами исследования, используемыми в экспериментальной и клинической иммунологии с аллергологией. Приведены основные характеристики и этапы использования разнообразных иммунологических методов, часть которых легко воспроизвести в рамках практических занятий на кафедре иммунологии и на смежных кафедрах медицинских и биологических вузов.

Иммунологические методы, применяемые как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях, делятся по крайней мере на 8 групп.

I. Методы определения или детекции тех или иных веществ, характеризующихся наличием уже полученных специфичных антител против них. Эти методы принято называть в международной специальной литературе методами иммуноанализа. В соответствии с применяемыми технологиями визуализации взаимодействия антитела и антигена иммуноанализ подразделяется на:

1. методы агглютинации корпускулярных антигенов (непосредственная агглютинация антигена, гемагглютинация, латексагглютинация, нефелометрия);
2. методы с использованием технологии гемолиза (тесты фиксации комплемента, торможения фиксации комплемента, метод подсчета антителообразующих клеток по Йерне);
3. методы преципитации комплексов «антиген—антитело» в гелях (методы Оухтерлони, Элека, Манчини и др.);
4. иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ, имму-нофлюоресцентный анализ — наиболее высокочувствительные и наиболее употребимые в настоящее время виды иммуноанализа.

II.    Методы фракционирования — физическое разделение растворимых молекул или клеток иммунной системы:

1. выделение иммуноглобулинов высаливанием солями серной кислоты;
2. методы хроматографии (высокоэффективная; аффинная и др.);
3. центрифугирование в средах с градиентами плавучей плотности (выделение мононуклеарных клеток центрифугированием на фиколл-гепаке; выделение нейтрофилов седиментацией на растворе желатина, декстрана и др.);
4. электрофорез;
5. проточная цитофлюорометрия, в том числе с использованием тетрамерных комплексов.

III.    Иммуногистохимические методы (иммунофлюоресцентная микроскопия; микроскопия препаратов тканей или клеток с фиксированными антителами, меченными ферментной меткой).
IV.    Методы молекулярной биологии (полимеразная цепная реакция; иммуноблоттинг: Western-блот определяет белок, Southern-блот определяет ДНК, Northern-блот определяет РНК).
V.    Генетические методы:

1. методы направленного мутагенеза — «нокаут» и «нокин»;
2. методы изучения экспрессии генов и методы картирования и исследования конкретных мутаций (технологии микроэрреев).

VI.    Методы биотехнологии — клонирования молекул, ПЦР, методы получения рекомбинантных белков, клеток (гибридомные технологии), создание линий инбредных животных, биотехнологические методы получения и оценки вакцин.
VII.    Методы изучения свойств нативных клеток иммунной системы в культурах in vitro (методы биологического тестирования цитокинов; методы оценки пролиферации клеток; методы исследования факторов транскрипции и др.).
VIII.    Методы исследования функций и взаимодействия клеток in vivo (радиационные химеры; сканирование меченых клеток in vivo и др.).
Проводится наиболее детальное описание некоторых тестов, подходящих для практических занятий со студентами (обозначения: «Лабораторная работа 1-1» и т.д.).
Особое внимание в книге уделяется проблеме цитокинов. В соответствующем разделе не только представлены конкретные методы их идентификации, но и сформулирован подход к оценке системы цитокинов в целом, что очень способствует формированию суждения о комплексности этой важнейшей для организма системы межклеточных медиаторов. Особо подчеркнем: сейчас в клинической медицине отмечается рост числа патологических процессов, обусловленных избыточной или недостаточной продукцией цитокинов.
Учебное пособие по иммунологии предназначено студентам врачебных и биологических специальностей медицинских вузов и университетов, а также ординаторам, аспирантам, врачам всех специальностей, специалистам, работающим в разных областях биологии и медицины.

Ковальчук Л.В.. Иммунология - Практикум скачать

Содержание практикума

«Иммунология»

Объекты исследования в иммунологии

1. Инбредные животные
2. Линии мышей с генетическими дефектами, затрагивающими иммунную систему
3. Линии мышей с аутоиммунной патологией
4. Биологические материалы для исследований
5. Методические особенности работы с иммунокомпетентными клетками

Методы разделения клеток периферической крови

1. Выделение лейкоцитов
2. Выделение мононуклеарных клеток
3. Выделение моноцитов
4. Выделение нейтрофилов
5. Аналитическая и препаративная цитофлуориметрия
6. Иммуномагнитная сепарация клеток

Методы изучения функциональной активности клеток иммунной системы in vitro и in vivo

1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов
2. Оценка клеточной цитотоксичности
3. Оценка функциональной активности фагоцитов
4. Культура клеток in vivo

Иммуноанализы

1. Методы определения преципитатов антител с антигенами в геле
2. Иммуноферментный и радиоиммунный анализы
3. Чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность тест-систем иммуноанализов
4. Определение количества клеток, секретирующих тот или иной продукт, — метод ELISPOT
5. Методы исследования внутриклеточных цитоплазматических и ядерных белков — факторов транскрипции, сигнальных молекул и других

Гибридомная технология. Моноклональные антитела
Генетические методы исследования в иммунологии

1. Полимеразная цепная реакция
2. Исследование экспрессии генов методом микрочипов
3. Получение мышей с нокаутом (knock-out) и нокином (knockin) генов — метод направленного мутагенеза
4. Применение регуляторных микро-РНК в иммунологических исследованиях

Методы оценки системы цитокинов

Литература